TSHR及TRAb研究的實(shí)際應(yīng)用

更新時(shí)間：2022-07-27

點(diǎn)擊次數(shù)：3167

促甲狀腺激素受體(TSH Receptor,TSHR)在體內(nèi)外場(chǎng)景中均具有廣泛的應(yīng)用。人抗TSHR單克隆抗體可用于TSHR自身抗體(TRAb)的檢測(cè)，有助于自身免疫性甲狀腺疾病的診斷和治療。這些TSHR單抗中，以M22™代替現(xiàn)有檢測(cè)法中的TSH是目前靈敏度和特異性*高的檢測(cè)方法。目前實(shí)現(xiàn)商品化的M22™已作為世界衛(wèi)生組織促甲狀腺抗體的國(guó)際參考物質(zhì)，用于TRAb檢測(cè)方法的校準(zhǔn)。

具備熱穩(wěn)定性的TSHR胞外結(jié)構(gòu)域，可在體外環(huán)境中穩(wěn)定結(jié)合患者血清中的TRAb，這為提高TRAb檢測(cè)法的特異性帶來積極的實(shí)用價(jià)值。除此之外，人TSHR單克隆抗體作為新的治療手段也有很好的前景，有望輔助控制Graves病、Graves眼病和甲狀腺癌患者體內(nèi)的TSHR活性。

背景

早在1956年，Adams和Purves就shou次報(bào)道了甲狀腺疾病患者血清中，存在與TSH不同的長(zhǎng)效甲狀腺刺激因子(LATS) [1]。當(dāng)時(shí)研究發(fā)現(xiàn)LATS刺激甲狀腺的機(jī)制與血清蛋白的IgG部分相關(guān)。1974年，RSR創(chuàng)始人Smith博士與Hall的聯(lián)合研究證實(shí)了Graves病患者血清中這種因子實(shí)質(zhì)上是特異性靶向TSHR的自身抗體（即TRAb），而TRAb對(duì)TSHR的刺激是造成Graves病患者甲狀腺功能亢進(jìn)的病因[2]。這一研究結(jié)果促進(jìn)了第一代TRAb體外檢測(cè)方法的發(fā)展，為自身免疫性甲狀腺疾病(AITD)的輔助診斷和管理提供依據(jù)。

TSHR研究的下一個(gè)重要里程碑是1989 - 1990年，在四個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)室中克隆了TSHR基因[3-7]。這為TSHR單克隆抗體的體外制備提供更多基礎(chǔ)。

2003年，Smith博士從一名Graves病患者的外周血淋巴細(xì)胞中，分離出促甲狀腺激素受體單克隆自身抗體(稱為M22™)[8]。隨后發(fā)現(xiàn)的多種TSHR單克隆自身抗體中，按生理功能又可為兩種阻斷型單抗(5C9和K1-70)和一種刺激型單抗(K1-18)[9]。重組TSHR基因表達(dá)技術(shù)的發(fā)展，配合目前已發(fā)現(xiàn)的TSHR單抗，使TSHR富亮氨酸重復(fù)結(jié)構(gòu)域(LRD)可與M22和K1-70的Fab片段結(jié)合為抗原抗體復(fù)合物，以結(jié)晶形式得以提取[10,11]。這為后續(xù)研究中TSHR LRD與兩種不同效應(yīng)的單克隆抗體間分子的相互作用提供助益[10,11]。

當(dāng)前多項(xiàng)研究成果證實(shí)，體外環(huán)境中的小鼠胚胎干細(xì)胞可以通過TSH刺激，定向轉(zhuǎn)化為功能正常的甲狀腺濾泡細(xì)胞。這為長(zhǎng)期接受激素替代治療的甲狀腺疾病患者，開辟了功能恢復(fù)性治療的新前景[12,13]。我們?cè)诮诘难芯恐羞€建立了Graves眼病(GO)的小鼠模型[14]，并制備了具有熱穩(wěn)定性的TSHR LRD制劑，shou次解析了無配體的糖蛋白激素受體結(jié)構(gòu)域的晶體結(jié)構(gòu)（2.83 Å分辨率）[15]。這些重大的科學(xué)結(jié)果不斷促進(jìn)對(duì)AITD患者診斷、監(jiān)測(cè)以及管理的改進(jìn)。

TRAb的體外應(yīng)用實(shí)例

如上所述，在Graves病發(fā)病機(jī)制中，患者血清中的自身抗體對(duì)TSHR的刺激起核心作用。因TRAb檢測(cè)的重要性，TRAb的檢測(cè)方法也歷經(jīng)了多代的發(fā)展：

一代檢測(cè)：

液相檢測(cè)法，利用血清TRAb可以抑制放射性I-125標(biāo)記的TSH與TSHR相結(jié)合的特性，使用聚乙二醇將抗原抗體復(fù)合物沉淀[16]。該檢測(cè)法是Graves病診斷的一個(gè)里程碑。在早期開展的生物檢測(cè)法中，通常以刺激型抗體TSAB或TSH對(duì)表達(dá)TSHR的活細(xì)胞進(jìn)行刺激，以其產(chǎn)生的第二信使cAMP作為檢測(cè)標(biāo)志物來間接檢測(cè)TRAb。該試驗(yàn)法耗時(shí)較久且流程復(fù)雜，不適宜大規(guī)模檢測(cè)。一代液相法作為替代方案改變了這一局面。

二代檢測(cè)：

第二代檢測(cè)改為固相檢測(cè)法，樣品中的TRAb與固定在ELISA微孔或塑料管上的TSHR相結(jié)合，隨后與生物素或I-125標(biāo)記的TSH反應(yīng)實(shí)現(xiàn)檢測(cè)[17]。固相檢測(cè)法實(shí)現(xiàn)了非放射性同位素標(biāo)記和檢測(cè)自動(dòng)化，與第一代檢測(cè)法相比，提高了方法學(xué)的靈敏度和特異性。

三代檢測(cè)：

在新的第三代檢測(cè)中，以M22-生物素替代二代檢測(cè)中的TSH-生物素，從而進(jìn)一步提高了靈敏度和特異性[18]。與二代檢測(cè)中TSH與TSHR間的結(jié)合相比，M22因其復(fù)合物不易解離，在TRAb的競(jìng)爭(zhēng)抑制法檢測(cè)中更具有優(yōu)勢(shì)。這一特性使配體在嚴(yán)格的洗滌步驟里保持緊密結(jié)合，使其更適合用于自動(dòng)化檢測(cè)系統(tǒng)。第三代TRAb檢測(cè)目前在各地的各個(gè)平臺(tái)上廣泛應(yīng)用。即使檢測(cè)時(shí)長(zhǎng)控制在半小時(shí)內(nèi)，也能保持良好的靈敏度和特異性[18,19]。

TRAb的濃度通常以IU/L表示，單位定義參考了國(guó)家生物標(biāo)準(zhǔn)和控制研究所(NIBSC)提供的世界衛(wèi)生組織(WHO)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。該類物質(zhì)通常用于TRAb檢測(cè)方法的校準(zhǔn)。第一代標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(編號(hào)90/672)源自一位患者的捐贈(zèng)。隨著第一代標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的耗竭，M22™的開發(fā)誕生了第二代國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(編號(hào)08/204)。在NIBSC 08/204標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中，每支安瓿的正常人血清中含有1 μg凍干M22 IgG。當(dāng)前M22™已規(guī)模化投產(chǎn)，實(shí)現(xiàn)了從實(shí)驗(yàn)室研究向產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的轉(zhuǎn)變。（RSRTJ解讀：保證了M22的產(chǎn)出及供應(yīng)問題。）

TSHR的體外應(yīng)用實(shí)例

作為甲狀腺自身抗體的靶抗原之一，TSHR固有的不穩(wěn)定性和難以純化是阻礙其大規(guī)模應(yīng)用的難點(diǎn)。(RSRTJ解讀：生產(chǎn)廠家常見問題)RSR利用M22或K1-70兩款單抗的 Fab片段對(duì)TSHR LRD部分進(jìn)行穩(wěn)定化，克服了上述困難，從而進(jìn)一步探究?jī)煞N抗原抗體復(fù)合物的分子結(jié)構(gòu)[10,11]。受限于游離TSHR較差的穩(wěn)定性，我們至今未能成功純化游離態(tài)TSHR LRD。因此通過系統(tǒng)性誘發(fā)定向突變，獲取熱穩(wěn)定性抗原蛋白的策略已證明其價(jià)值。RSR對(duì)人TSHR片段22 - 260 (TSHR260)序列中的氨基酸進(jìn)行系統(tǒng)性突變，并對(duì)突變蛋白在42℃條件下的熱穩(wěn)定性進(jìn)行了測(cè)試。經(jīng)過一系列篩選和重組，我們最終獲得包含六處突變的強(qiáng)熱穩(wěn)定性TSHR。該突變抗原命名為TSHR260-JMG55，其穩(wěn)定性約為野生型TSHR260的900倍[15]。(RSRTJ解讀：RSR新品-TRAb SPEC試劑盒采用了該原料。)

用TSHR260-JMG55替換對(duì)應(yīng)片段后的全長(zhǎng)TSHR，無論是對(duì)TSH或M22的刺激信號(hào)反饋，還是結(jié)合Graves病患者的TSHR自身抗體時(shí)，耐熱型TSHR均與野生型TSHR的性能表現(xiàn)接近[15]。這些試驗(yàn)均證實(shí)，耐熱突變不影響TSHR本身的抗原性。

實(shí)戰(zhàn)應(yīng)用

穩(wěn)定的濃縮TSHR260-JMG55制劑可用于TRAb檢測(cè)法的特異性確認(rèn)。當(dāng)送檢樣品中TRAb檢測(cè)結(jié)果不明確時(shí)，使用TSHR260-JMG55制劑與待確認(rèn)樣本共同孵育可實(shí)現(xiàn)特異性確認(rèn)試驗(yàn)。如果測(cè)試樣品中存在TRAb，則被TSHR260-JMG55結(jié)合，結(jié)合處理后抗體水平降低的現(xiàn)象，可解讀為抗體陽性。(RSRTJ解讀：RSR新品-TRAb SPEC試劑盒的檢測(cè)原理。)此外，耐熱的純化TSHR260-JMG55也可用于TRAb新檢測(cè)法的研發(fā)。

TSHR的體內(nèi)應(yīng)用研究

在目前的設(shè)想中，穩(wěn)定的TSHR制劑可以對(duì)患者體內(nèi)的血清TRAb特異性免疫吸附。在需要從患者外周循環(huán)中緊急清除TRAb的危急臨床危重情況下，通過TRAb與TSHR260-JMG55結(jié)合的機(jī)制，將TRAb從患者血漿中分離，從而提供快速有效的治療效果。

TSHR阻斷型人單抗K1-70是一種針對(duì)TSH和刺激型抗體產(chǎn)生刺激信號(hào)的“天然”強(qiáng)抑制劑[20]。K1-70用于人體可實(shí)現(xiàn)對(duì)Graves病和Graves眼病（GO）中的甲狀腺功能亢進(jìn)的控制，以及對(duì)甲狀腺癌的病程進(jìn)展產(chǎn)生潛在的收益[21-23]。此外，利用K1-70對(duì)TSHR的高親和性和特異性，可能有助于組織影像學(xué)和輔助藥物進(jìn)行靶向定位。(RSRTJ解讀：原料 K1-70的擴(kuò)展應(yīng)用）

腫瘤治療展望

在甲狀腺癌的控制策略上也可提供新思路：通過一種含TSH片段的納米脂質(zhì)體，裝載化療藥物后靶向到達(dá)病灶處的TSHR[24]。另一種方法基于TSHR結(jié)合碳納米管，這種納米管能將外部光能轉(zhuǎn)化為熱能，從而在局部殺死癌細(xì)胞[25]。此外，針對(duì)TSHR的小分子拮抗劑，通過抑制信號(hào)通路的方法來抑制甲狀腺癌進(jìn)展[26]。目前在Graves病患者的臨床試驗(yàn)中，采用K1-70單次遞增劑量給藥，已開展涉及安全性、耐受性、藥代動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)的I期臨床研究（結(jié)果已于22年發(fā)表）。

K1-70藥用化實(shí)例

一名患有Graves病、嚴(yán)重GO和局部晚期伴遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的高分化甲狀腺濾泡癌的女性患者，曾接受了K1-70作為藥物的藥效觀察[27,28]。給藥前該患者GO臨床活動(dòng)評(píng)分(CAS)為6/7，復(fù)視，雙眼突出量21 mm，伴水腫、眼瞼腫脹、眼球運(yùn)動(dòng)時(shí)疼痛、眼瞼紅斑。她開始接受為期3周，個(gè)體化定制劑量的K1-70用藥，旨在中和她體內(nèi)高水平的促甲狀腺刺激型自身抗體。第一次給藥時(shí)TRAb為130 IU/L，甲狀腺刺激活性>2000%。該患者同時(shí)服用樂伐替尼治療甲狀腺癌。患者反饋稱在開始K1-70治療后不久，她的眼部癥狀有所改善；CAS提高到0-1/7，雙側(cè)突出量改善為19 mm，可通過手術(shù)矯正復(fù)視。接受K1-70治療期間，患者恢復(fù)了駕駛能力，GO一并轉(zhuǎn)入穩(wěn)定期。在樂伐替尼因副作用而停藥期間，僅K1-70單獨(dú)用藥，也觀察到腫瘤進(jìn)展放緩。在持續(xù)K1-70治療2年且劑量提高至120 mg/次時(shí)，該患者身上仍未觀察到不良反應(yīng)。

這些早期研究表明，用K1-70阻斷TSHR活性的體內(nèi)治療方式，在控制Graves病、GO和甲狀腺癌中甲狀腺功能亢進(jìn)上具有廣闊的應(yīng)用前景。

更多關(guān)于RSR廠家抗體的介紹：RSR甲狀腺自身免疫系列抗原抗體

參考文獻(xiàn)：Furmaniak, J., et al. "Practical applications of studies on the TSH receptor and TSH receptor autoantibodies." Endocrine 68.2 (2020): 261-264.

上一條一例GAD 65和P/Q-VGCC抗體陽性的自身免疫性癲癇病例報(bào)告
下一條血清素(5-羥色胺)檢測(cè)試劑盒使用說明