青年發病成年型糖尿病(MODY)是一種常染色體顯性遺傳的糖尿病類型，其發病年齡通常在25歲之前。MODY3是亞洲人群中最常見的MODY亞型，由肝細胞核因子1A(HNF1A)雜合突變引起。進行性β細胞功能障礙伴胰島素分泌不足是MODY3的主要臨床特征。MODY3患者通常表現為由于腎臟葡萄糖重吸收減少所致的糖尿。由于不同家庭的臨床表現不同，大多數MODY3患者經常被誤認為1型糖尿病或早發性2型糖尿病。對于這些患者，可以給予胰島素或二甲雙胍來維持正常血糖。目前有研究證明磺脲類藥物對MODY3患者的降糖效果優于二甲雙胍。因此，對MODY3進行準確的診斷和治療是非常重要的。越來越多的基因分析為區分單基因糖尿病(包括MODY3)和1型或2型糖尿病提供了機會。

HNF1A是一種轉錄因子，已被證實在胰腺、肝、腎、胃和腸中高表達。它負責調節許多肝臟特異性基因，以及涉及葡萄糖代謝的關鍵基因。到目前為止，HGMD數據庫提供了500多個HNF1A突變，從啟動子到3’UTR區域，多達250個突變可以導致MODY3。然而位于內含子等非編碼區的突變卻鮮有報道和研究。內含子-外顯子連接處的一些突變可能會破壞原有的剪接位點，而位于內含子剪接增強子的其他突變可能會影響剪接效率。這些剪接突變占致病突變的15%-30%。盡管如此，關于剪接突變功能評估的研究尚不充分。

在這項研究中，我們在一位30歲無肥胖的女性早發性糖尿病患者中發現了HNF1A內含子7內含子剪接位點上游的第6個核苷酸突變，命名為IVS7-6G>A。該突變以前在MODY患者中被發現，并在轉化的淋巴母細胞中被證明這種突變會導致外顯子7的跳過。然而，該突變的功能后果仍有待進一步研究。在此，我們用體外“微基因"實驗證實IVS7-6G>A突變確實影響HNF1A mRNA的剪接。重要的是，我們發現錯誤剪接干擾了HNF1A的亞細胞定位和反式激活。HNF1A的TAD在核化中也起作用，其中殘基282-501比殘基502-631更重要。我們的觀察重在理解內含子突變引起的疾病，并增加對MODY3致病機制的理解。

1. MODY3家族的臨床特征和突變篩查

在MODY3家族中，先證者和她的母親分別在15歲和30歲時被診斷出患有糖尿病，她的姨媽的葡萄糖耐量受損。表1總結了先證者及其母親的詳細臨床特征。在先證者和她的母親中，口服葡萄糖耐量試驗（OGTT）2小時后血糖水平顯著升高，胰島素分泌受損。在該研究中，患者母女已使用英國RSR公司 GADAb、IA-2Ab、 ZnT8Ab ELISA試劑盒進行抗體篩查，確認抗體均為陰性，排除了自身免疫因素后再按計劃接受測序。先證者接受小劑量的格列喹酮（45 mg/天）治療，血糖控制良好（空腹血糖為5-6 mmol/L，餐后2小時血糖為5-9 mmol/L）。由于正處于哺乳期，她目前正在接受胰島素治療，并且糖尿病得到了很好的控制（HbA1C 6.3%）。然而，格列美脲（6 mg/天）不能很好地控制先證者母親的糖尿病，并且在40歲時開始遭受糖尿病并發癥，包括糖尿病腎病，糖尿病性周圍血管病變，糖尿病性神jing病和糖尿病視網膜病變。出現癥狀時即接受胰島素治療。在先證者中檢測到雜合的HNF1A內含子突變IVS7-6G>A，譜系表明先證者的突變是從她的母親那里遺傳的。

2. HNF1A IVS7-6G A基因突變導致mRNA剪接異常和mRNA不穩定

3. HNF1A IVS7-6G A蛋白（L502S fs*和G437A fs*）的降解速率與野生型相似

4. HNF1A IVS7-6G > A突變降低MIN6細胞的轉錄活性

首先，在四個報告基因實驗中，L502S fs*、G437A fs* 和 A501* 的轉錄活性約為野生型的 30-50%，TADm 約為野生型的 20-30%（圖 4C-F）。其次，L502S fs* 和 A501* 在四個報告基因實驗中沒有顯著差異，這可能表明 L502S fs* 的 47 個異常 C 端氨基酸沒有造成負面影響（圖 4C-F，第二和第四小節）。第三，與 A501* 相比，TADm 在 GLUT2、CRP 和白蛋白中的轉錄活性降低了 50% 以上，這可能表明 TAD 的殘基 282-501 比殘基 502-631 更有效（圖 4C、E、F ，第四和第五小節）。根據我們的結果，我們不知道不同的部位是否與不同的靶基因有選擇性的相互作用。由于 HNF1A 具有 N 端二聚結構域并且通常與同型二聚體結合，因此涉及顯性負效應。結果顯示，與L502S fs*或G437A fs*共表達的野生型值比野生型低30%~40%，差異顯著（圖4C和D，最后2條）。

圖4 MIN6細胞中靶基因啟動子的野生型和突變型HNF1A轉錄活性分析。

5. HNF1A IVS7-6G > A 突變損害了 MIN6 細胞的細胞內定位，在高糖條件下可能會加重

我們發現與MODY3相關的HNF1A IVS7-6G>A突變引起異常的mRNA剪接，形成具有截短的TAD的異常蛋白。HNF1A的TAD不僅對其調節活性很重要，而且對其成核也很重要。對于HNF1A的功能，TAD處的殘基282–501比502–631更重要。本研究揭示了HNF1A中內含子突變對基因活性和表達的影響同樣會引起胰島β細胞功能異常,為增加MODY3致病機制的理解提供更多依據。

參考文獻：Wang M, Shu H, Xie J, Huang Y, Wang K, Feng R, Yu X, Guan J, Feng W, Liu M. An intron mutation of HNF1A causes abnormal splicing and impairs its activity as a transcription factor. Mol Cell Endocrinol. 2022 Apr 5;545:111575.

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